Gesamtgenomanalyse und Kälteanpassungsstrategien von Pseudomonas sivasensis W

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 14190 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mikrobielle Gemeinschaften in Feuchtgebieten spielen eine Schlüsselrolle für die Ökologie und Stabilität der Erde. Um die Kälteanpassungsmechanismen von Bakterien in Plateau-Feuchtgebieten aufzuklären, führten wir vergleichende Genomanalysen von Pseudomonas sivasensis und eng verwandten Abstammungslinien durch. Das Genom von P. sivasensis W-6, einem kälteadaptierten Bakterium, das aus dem Feuchtgebiet des Napahai-Plateaus isoliert wurde, wurde sequenziert und analysiert. Die Genomlänge betrug 6.109.123 bp mit einem G+C-Gehalt von 59,5 %. Die Genvorhersage ergab 5360 proteinkodierende Sequenzen, 70 tRNAs, 24 Geninseln und 2 CRISPR-Sequenzen. Das Isolat enthielt Hinweise auf horizontale Gentransferereignisse während seiner Evolution. Zwei Prophagen wurden vorhergesagt und deuteten darauf hin, dass W-6 ein Lysogen war. Die Kälteadaption des W-6-Stammes zeigte eher psychrophile als psychrotrophe Eigenschaften. Das an Kälte angepasste Bakterium W-6 kann Glykogen und Trehalose als Ressourcen nutzen, die mit kohlenhydrataktiven Enzymen verbunden sind, und in einer Umgebung mit niedrigen Temperaturen überleben. Zu den kälteadaptierten Mechanismen des W-6 gehörten außerdem die Membranfluidität durch Veränderung des ungesättigten Fettsäureprofils, die Zweikomponenten-Regulationssysteme, die Antisense-Transkription, die Rolle der rpsU-Gene im Translationsprozess usw. Die Die genomweite Analyse von W-6 lieferte ein tieferes Verständnis der kälteadaptierten Strategien von Bakterien in Umgebungen. Wir haben den adaptiven Mechanismus des psychrophilen W-6-Stamms für das Überleben in einer kalten Umgebung aufgeklärt, was eine Grundlage für weitere Untersuchungen zur Wirt-Phagen-Koevolution lieferte.

Mit der kontinuierlichen Verbesserung der Sequenzierungstechnologie hat die mikrobielle Genomanalyse den Inhalt der Datenbank zunehmend bereichert und erweitert. Basierend auf den repräsentativen Arten in der Systementwicklung zwischen der vergleichenden Analyse von Genen und Genfamilien deckt die vergleichende Genomik zur Erstellung der genetischen Karte in der Systementwicklung den Ursprung und die Funktion der Gene und Genfamilien sowie ihren Komplikations- und Diversifizierungsmechanismus auf Prozess der Evolution.

Kalte Umgebungen sind weit verbreitet und machen etwa 75 % der Erde aus1. Kälteadaptierte Mikroorganismen können anhand der Wachstumstemperatur in zwei Kategorien eingeteilt werden: psychrophile und psychrotrophe Mikroorganismen. Sie nutzen eine Reihe von Stoffwechselstrategien, um in Umgebungen mit niedrigen Temperaturen zu wachsen. Es akkumuliert Glykogen und Glukoneogenese als Energie, um die Frostschutzfähigkeit zu verbessern2,3,4,5, die Fluidität der Zellmembranen aufrechtzuerhalten6, mit oxidativem Stress durch niedrige Temperaturen umzugehen7 und die Expression molekularer Chaperone, extrazelluläre Polysaccharide spielten ebenfalls eine wichtige Rolle8. In den letzten Jahren wurde aufgrund des Anwendungspotenzials von Niedertemperatur-Mikroorganismen und ihren Produkten über Studien zur mikrobiellen Genomsequenzierung aus kalten Umgebungen berichtet8,9.

Pseudomonas spp. gehören zu den gramnegativen Bakterien, sind meist aerob oder fakultativ anaerob und in der Natur weit verbreitet. Bisher wurden nur 5 Genome von P. sivasensis auf Basis der NCBI GenBank sequenziert, wobei der BsEB-1-Stamm am vollständigsten sequenziert wurde. Unter der Genomgröße aller veröffentlichten P. sivasensis-Genomen betrug die Größe etwa 6,2 Mbit/s. Der GC-Gehalt verschiedener P. sivasensis-Genomen lag bei etwa 60 %.

Glykogen ist eine wichtige Nahrungswährung und Energiequelle. Im Vergleich zu anderen Zuckern ist Glukose eine optimale Kohlenstoffquelle. Unter verschiedenen abiotischen Belastungen wie niedrigen Temperaturen, Nährstoffmangel, osmotischer Regulierung und pH-Aufrechterhaltung ist die Glykogensynthese eines der gut entwickelten Energiespeichersysteme, mit denen sich Bakterien anpassen und überleben können10. Der Glykogenstoffwechsel ist ein komplexes Interaktionsnetzwerk, an dem mehrere Gene und Wege beteiligt sind11. Die wichtigsten fünf Enzyme sind am Glykogenstoffwechsel beteiligt: ADP-Glucose-Pyrophosphorylase (GlgC), Glykogen-Synthase (GlgA), Glykogen-Branching-Enzym (GlgB), Glykogen-Phosphorylase (GlgP) und Glykogen-Debranching-Enzym (GlgX)12. Bakterien entwickeln eine passive Energiesparstrategie, beispielsweise Nährstoffentzug mit langsamem Glykogenabbau. Der Stoffwechsel von Maltodextrin hängt mit dem Glykogenstoffwechsel zusammen, und 4-Glucanotransferase (MalQ) sorgt für die Wiederverwertung von Maltose zu Maltodextrinen13.

Trehalose ist ein Disaccharid aus zwei D-Glucose-Molekülen, die durch eine glykosidische Bindung verbunden sind, und spielt eine wichtige Rolle beim Schutz von Bakterien vor einer Reihe von Belastungen14. Es ist bekannt, dass Trehalose Mikroben wie Saccharomyces cerevisiae und Escherichia coli vor dem Austrocknen schützt15,16. Abiotischer Stress übt einen Selektionsdruck auf die Umweltbeständigkeit der Bakterien aus und kann einige Signalwege aktivieren oder bestimmte Gene exprimieren, was das Überleben der Bakterien unterstützen könnte. An Bakterien sind fünf mit Trehalose in Zusammenhang stehende Wege beteiligt: TPS/TPP (OtsBA), TreYZ, TreS, TreP und TreT-Biosynthesewege14. Der Metabolismus von Trehalose und Glykogen hängt über den treS-pep2-glgE-glgB-Signalweg zusammen17. Im Allgemeinen gibt es in einem einzelnen Bakterium mehrere Synthesewege, was auf die Bedeutung kompatibler Modi hinweist.

In dieser Studie wurde eine Sequenzierung des gesamten Genoms von P. sivasensis W-6, einem kälteadaptierten Bakterium, das aus dem Feuchtgebiet des Napahai-Plateaus isoliert wurde, durchgeführt, um Beweise dafür zu liefern, wie der Stamm W-6 in einer kalten Umgebung reagierte. Es liefert Informationen über neue Mikroorganismen und ihre Anpassungsfähigkeit in einer Umgebung mit niedrigen Temperaturen.

Das Wachstum des Stammes W-6 wurde bei verschiedenen Temperaturen von 4, 10, 15, 20, 25, 30 und 37 °C gemessen. Es ist ersichtlich, dass der Stamm W-6 im Bereich von 4 bis 30 °C wachsen könnte, wobei die optimale Wachstumstemperatur 15 °C beträgt. Anschließend wurde die Wachstumskurve des Stammes W-6 durch Nachweis von OD600 bei 15 °C erstellt (Abb. S1). Der Stamm W-6 trat nach 10 Stunden in die logarithmische Wachstumsphase ein und erreichte die stabile Phase nach 40 Stunden. Der Stamm W-6 war also eher ein psychrophiles als ein psychrotrophes Bakterium. Basierend auf der 16S-rRNA-Genamplifikation (1501 bp, NCBI-Zugangsnummer MF949058), der DNA-Sequenzierung und BLASTn in GenBank wurde das Isolat als P. sivasensis identifiziert.

Nachdem die Originaldaten durch Sequenzierung erhalten wurden, wurden sie gefiltert und korrigiert, und dann wurde die Sequenz gespleißt und zusammengesetzt. Ein Gerüst wurde erworben, zusammengebaut und hatte eine Gesamtlänge von 6.109.123 bp mit einem G+C-Gehalt von 59,5 % (Tabelle S1). Die genomische Kreiskarte von P. sivasensis W-6 ist in Abb. 1 dargestellt. Tabelle S2 zeigte, dass die Gesamtgenomlänge und der G+C-Gehalt besser mit denen anderer P. sivasensis-Stämme vergleichbar waren. Darüber hinaus wurden 19 rRNAs und 70 tRNAs aus P. sivasensis W-6 gewonnen.

Genomkreiskarte von Pseudomonas sivasensis W-6. Der äußerste Kreis sind die Positionskoordinaten der Genomsequenz. Vom äußeren Kreis zum inneren Kreis sind: Positivstrang-Gen, Negativstrang-Gen, Farbe zeigt COG-Klassifizierung an, ncRNA (schwarz: tRNA, rot: rRNA), GC-Gehalt (rot > Mittelwert, blau < Mittelwert), GC-Skew (lila < 0, orange > 0).

Den KEGG-Annotationsinformationen zufolge wurden in W-6 3063 Gene mit 115 Signalwegen annotiert, die in fünf Kategorien eingeteilt werden können: Stoffwechsel, genetische Informationsverarbeitung, Umweltinformationsverarbeitung, zelluläre Prozesse und Gewebesysteme (Abb. 2a). Die Anzahl der Stoffwechselwege-Gene betrug 1477, was 48,23 % der annotierten Gene ausmachte. Viele sekundäre Stoffwechselbiosynthesen, mikrobieller Stoffwechsel in verschiedenen Umgebungen, Antibiotika-Biosynthese, ABC-Transportersystem und Zweikomponentensystem wurden ebenfalls mit 349, 289, 261, 241 bzw. 199 Genen annotiert. ABC-Transporterproteine sind in Mikroorganismen weit verbreitet. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Nährstoffaufnahme von Ionen, Monosacchariden, Aminosäuren, Phospholipiden, Peptiden, Polysacchariden und Proteinen. Das Zweikomponentensystem reguliert den Aminosäurestoffwechsel und vermittelt die Stressreaktion auf die äußere Umgebung. Darüber hinaus verfügten die Wege des Kohlenstoffstoffwechsels und des bakteriellen Sekretionssystems über eine große Anzahl von Genen.

Funktionskategorisierung von Genen des Pseudomonas sivasensis W-6. (a) Basierend auf der KEGG-Datenbank. Die verschiedenen Farben repräsentieren unterschiedliche Pfade und die Zahlen im Diagramm stellen die Anzahl der Gene in diesen Pfaden dar. Die grüne Farbe stellt KEGG-Wege im Zusammenhang mit dem Zellstoffwechsel dar, die violette Farbe stellt KEGG-Wege im Zusammenhang mit der Verarbeitung genetischer Informationen dar, die blaue Farbe stellt KEGG-Wege im Zusammenhang mit der Verarbeitung von Umweltinformationen dar und die rosa Farbe stellt KEGG-Wege im Zusammenhang mit zellulären Prozessen dar. (b) COG-Funktionsklassifizierung des Pseudomonas sivasensis W-6-Genoms. Die verschiedenen Farben repräsentieren unterschiedliche COG-Funktionsklassifizierungen und die Zahlen im Diagramm stellen die Anzahl der Gene in solchen Signalwegen dar. (c) GO-Funktionsanmerkungsdiagramm von W-6. Die horizontale Achse stellt die Funktionsklassifikation dar, die in verschiedenen Farben angezeigt wird, und die vertikale Achse stellt die Anzahl der in jeder Funktionsklassifikation enthaltenen prädiktiven Gene dar.

Durch die COG-Funktionsanmerkung des W-6-Genoms (Abb. 2b) zeigte sich, dass der W-6-Stamm die meisten Proteine in der R-Klasse (allgemeine Funktionsvorhersage, 723) aufwies, gefolgt von der E-Klasse (Aminosäuretransport). und Stoffwechsel, 695), die T-Klasse (Signaltransduktionsmechanismus, 646), die L-Klasse (Replikation, Rekombination und Reparatur, 576) und die P-Klasse (Anorganischer Ionentransport und Stoffwechsel, 444). Diese Klassen machten 49,48 % der gesamten W-6-Proteine aus, was einen erheblichen Anteil aller Proteine ausmachte.

Die GO-Datenbank besteht aus drei Hauptkategorien: molekulare Funktion, zelluläre Komponente bzw. biologischer Prozess von Genen (Abb. 2c). Die Anzahl der Gene in der zellulären Komponente betrug 856 und 64 sowohl für zelluläre als auch für zytosolische Funktionen. Die Anzahl der Gene in der Kategorie der molekularen Funktionen war mit nur 546 am niedrigsten, aber 78 führten die Bindungsfunktion aus. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Gene, die an Stoffwechselprozessen, zellulären und zellulären Komponenten sowie Bindungsfunktionen beteiligt sind, am zahlreichsten waren, was darauf hindeutet, dass diese Funktionen bei W-6 eine Schlüsselrolle spielten.

Bei der funktionellen Annotation von W-6-kodierten Proteinen stellten wir fest, dass die meisten Proteine im W-6-Stamm Aminosäuretransport und -stoffwechsel, Signaltransduktionsmechanismus, Replikation, Rekombination und Reparatur sowie anorganischer Ionentransport und -stoffwechsel waren für 49,48 % der gesamten W-6-Proteine, was einen erheblichen Anteil aller Proteine darstellt. Nicht nur als Grundbausteine von Proteinen und Aminosäuren, sondern auch in freier Form in Zellen. Diese freien Aminosäuren waren entweder Vorläufer oder Zwischenprodukte des Stoffwechsels oder Speicherformen von freiem Ammoniak, um dessen toxische Wirkung auf den Körper zu beseitigen, wohingegen die Rolle dieser Proteine in Bakterien unklar war und weiter erforscht werden musste.

Ähnliche Annotationsergebnisse wurden bei der GO-Funktionsannotation des W-6-Genoms erhalten. Bis zu 113 funktionelle Gene, die zu biologischen Prozessgenen gehören, waren an Stoffwechselprozessen beteiligt. Stoffwechselwege machten 48,23 % der gesamten in der Stoffwechselwegannotation annotierten Gene aus. Somit entfiel der größte Anteil der Proteinfunktionen in W-6 auf stoffwechselbezogene Proteine.

Die genomischen Informationen zu fünf P. sivasensis-Stämmen sind in Tabelle S2 aufgeführt. Die Kollinearitätsanalyse wurde durchgeführt, indem W-6 mit den Nukleinsäuresequenzen der anderen vier P. sivasensis-Stämme in zwei Kombinationen kombiniert wurde (Abb. 3).

Kollinearitätsanalyse von fünf Pseudomonas sivasensis. Die violette Visualisierung lokal kollinearer Blöcke (LCBs) identifizierte die fünf Pseudomonas sivasensis-Genome. Jeder zusammenhängend gefärbte Bereich ist ein lokal kollinearer Block. LCBs unterhalb der Mittellinie eines Genoms befinden sich in der umgekehrten Komplementorientierung relativ zum Referenzgenom. Die farbigen Blöcke umfassen ähnliche Regionen zwischen den Bakteriengenomen. Rote vertikale Balken markieren intrachromosomale Grenzen. Mit dem Mauve können Benutzer Bereiche vergrößern, um die lokale Umlagerungsstruktur zu untersuchen.

W-6 zeigte eine stärkere Kollinearität mit vier P. sivasensis-Stämmen (2R045, BsEB-1, CCUG-57209 und P7), sowohl Vorwärts- als auch Rückwärtskollinearität. Die Unterschiede zwischen den Genomen W-6, 2R045, BsEB-1, CCUG-57209 und P7 waren gering, obwohl diese Bakterien aus unterschiedlichen Lebensräumen stammen. Gleichzeitig wurde CheckM18 zur Bewertung der Qualität und Vollständigkeit von W-6 verwendet und ergab eine Vollständigkeit von 99,66 %, eine Kontamination von 0,08 und eine starke Heterogenität von 0. FastANI (Standardparameter) wurde zur Berechnung des Durchschnitts des vollständigen Bakteriengenoms verwendet Nukleotididentität (ANI) von W-6 mit dem Referenzstamm P7 (99,04 %). Die Werte der digitalen DNA-DNA-Hybridisierung (dDDH) von W-6 mit den Referenzstämmen BsEB-1 und P7 betrugen 100 % bzw. 93 %. Die durchschnittliche Nukleotididentität (ANI, 88,3679 %) und dDDH (62,7 %) wurden zwischen Stamm W-6 und P. fluorescens SBW25 nachgewiesen. Wir konnten sehen, dass das vergleichende Genomergebnis viel höher war als die üblichen ANI-Werte von 92–97 %. Es zeigte sich, dass die ANI von W-6 mit der eng verwandten Art 99,04 % betrug. ANI und dDDH spiegeln weitgehend das traditionelle Konzept der Verwandtschaft wider, aber ANI-Werte stellen aufgrund der Variation der verglichenen Genome keine Genomentwicklung dar. Diese Studie klassifizierte den Stamm jedoch und ordnete ihn einem gesamten phylogenetischen Genombaum zu. Zwischen W6-Stämmen und den anderen Genomen wurde ein phylogenetischer Baum erstellt (Abb. 4). Wir konnten sehen, dass die W-6 der BsEB-1 am nächsten war. Es stimmte mit dem Ergebnis von dDDH überein. Somit gehörte der W-6-Stamm zu P. sivasensis.

Phylogenetischer Baum des W-6-Stammes. Phylogenetischer Baum, der die Verwandtschaftsverhältnisse von P. sivasensis W-6 und anderen Stämmen zeigt. Roter Punkt bedeutet W-6-Stamm.

Mobile genetische Elemente spielen eine entscheidende Rolle in der Genomentwicklung und ermöglichen die Anpassung von Bakterien an verschiedene Umweltbedingungen. Mobile genetische Elemente tragen auch zum horizontalen Gentransfer (HGT) bei.

Prophagen sind integrierte virale Formen in bakteriellen Genomen. Prophagensequenzen vermehren sich zusammen mit der bakteriellen Zellteilung vertikal zu den Nachkommen und tragen so zur genetischen Variabilität zwischen den Stämmen und zur adaptiven Evolution von Bakterien bei. Im Chromosom wurden zwei Prophagen-Loci vorhergesagt: phiW-6–1 (41.297 bp, Positionen 1.571.724–1.613.020) und phiW-6-2 (38.126 bp, Positionen 1.603.523–1.641.648). In diesen Regionen wurden elf bzw. siebzehn phagenbezogene Gene identifiziert (Tabelle S3). Die DNA-Synthesegene wurden in zwei Prophagen-Loci gefunden, was darauf hindeutet, dass diese nicht replikationsdefekt waren (Tabelle S4). Das phiW-6-1 ähnelte VW6S (94 %) und enthielt 45 ORF (Gen_1403-Gen_1447), einschließlich Rz-Protein (gp 24), Zellwand-Endolysin (gp 25), Schwanzfilament-Assemblierungsprotein (gp 27) und Schwanz Filamentdomänenprotein (gp 28) und Schwanzfilamentprotein (gp 30). Der Prophage phiW-6-2 ähnelte dem Phagen ФAH14a (87 %) und enthielt 53 ORF, darunter ФAH14a-Kopfmorphologieprotein (AH14a_p63), Portalprotein (AH14a_p62), terminales Enzym (AH14a_p61) und Kapsidprotein (AH14a_p66). ), Transkriptionsregulator (AH14a_p06) und DNA-Methyltransferase (AH14a_p05). Es gab 11 ORFs (gene_1437-gene_1447), die sich zwischen phiW-6-1 und phiW-6-2 überlappten, wie etwa Kopfmorphogeneseproteine, terminale Enzyme, einzelsträngige DNA-Bindungsproteine und Strukturproteine. Horizontal erworbene DNA, auch mobile genetische Elemente genannt, umfasst Transposons, Plasmide und Prophagen, wobei Prophagen der wichtigste Faktor sind19. Während des bakteriellen Lebenszyklus sind einige von Prophagen kodierte Gene aktiv und stehen in engem Zusammenhang mit Wirtsresistenz, Pathogenität, Antibiotikaresistenz, Virulenz oder Stoffwechsel, Biofilmbildung und Stress20,21,22,23. Prophage könnte den Wirt vor einer Doppelinfektion schützen und dem Wirt neue Resistenzen verleihen24. Prophagen sind vielfältig, entziehen sich der Immunität und unterstützen das Überleben und die Dominanz lysogener Phagen, die wichtige Treiber für die Gestaltung mikrobieller Ökosysteme sein können.

Die Transposonvorhersage des W-6-Genoms identifizierte nur ein Transposon, das sich bei 1.861.323–1.861.742 befindet. Es deutete darauf hin, dass die genetische Plastizität des Stammes W-6 möglicherweise nicht durch intragenomische Umlagerungen bestimmt wird.

CRISPRs sind Bestandteil vieler bakterieller Genome und CRISPRs wirken im Interferenzweg, um die Integrität des Genoms zu bewahren. Im W-6-Chromosom wurden zwei CRISPRs nachgewiesen. CRISPR1 hatte einen Abstandshalter und CRISPR2 hatte drei Abstandshalter.

Aufgrund der Allgegenwärtigkeit und des Missbrauchs von Antibiotika ist das Problem der Bakterienresistenz derzeit zu einem ernsten Problem geworden25. Es wird für die Analyse der in der natürlichen Umwelt isolierten Bakterienresistenz von großem Nutzen sein. Durch prädiktive Annotation wurden in den Datenbanken Antibiotic Resistance Genes Database (ARDB) und Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) insgesamt 56 Resistenzgene im W-6-Stamm gefunden (Tabelle S5), die in sieben Kategorien eingeteilt wurden: Effluxpumpen, Fluorchinolone, Polypeptide, β-Lactame, Polyphosphat, Peptidantibiotika und Elfamycin. Darunter befanden sich 46 Resistenzgene in Efflux-Pumpen, was 82,14 % der Gesamtzahl der Resistenzgene (10 Resistenzgene) ausmachte. Efflux-Pump-Gene hatten einen erheblichen Anteil an W-6 und könnten eine entscheidende Rolle spielen. Möglicherweise hängt es mit der Umgebung zusammen, in der sich W-6 befand, und der genaue Zusammenhang muss untersucht werden.

Von den identifizierten proteinkodierenden Genen in P. sivasensis W-6 wurden 725 signifikant annotiert und in Gruppen kohlenhydrataktiver Enzyme (CAZymes) (GH, GT, CE, AA, CBM und PL) klassifiziert. Es lieferte Einblicke in die Kohlenhydratverwertungsmechanismen von W-6. Abbildung 5 zeigt die 242 Glycosidhydrolasen (GHs), 261 Glycosyltransferasen (GTs), 80 Kohlenhydratesterasen (CEs), 16 Hilfsaktivitäten (AAs), 125 Kohlenhydratbindungsmodule (CBMs) und eine Polysaccharidlyase (PL). Diese Gene standen im Zusammenhang mit dem Aminosäuretransport, der Transkription, dem Kohlenhydrattransport und der Energieproduktion/-umwandlung, was darauf hindeutet, dass der Stamm W-6 CAZymes für die Energiespeicherung und den Kohlenhydratstoffwechsel nutzte. Die meisten Bakterien sind darauf angewiesen, Kohlenhydrate abzubauen und daraus Energie zu gewinnen. Beispielsweise sind GH13-Familien, die Stärke oder Zellulose abbauen könnten, und Trehalose-verwandte Gene (OtsA) an der Energiespeicherung beteiligt.

Genverteilung von CAZymes im W-6-Stamm. Die horizontale Achse stellt die Klassifikation der Enzyme dar (verschiedene Farben repräsentieren unterschiedliche Arten von Enzymen), und die vertikale Achse stellt die Anzahl der in dieser Klassifikation enthaltenen Gene dar.

Shigella sp. PAMC28760 könnte sich durch den Glykogenstoffwechsel anpassen und in kalten Umgebungen überleben26. Bacillus sp. TK-2 besaß durch CAZymes-Gene, die mit dem Abbau von Polysacchariden, die Cellulose und Hemicellulose enthalten, in Zusammenhang stehen, eine Anpassungsfähigkeit an die Kälteentwicklung9. Die Störung des Glykogenstoffwechselwegs beeinträchtigte das Überleben von E. coli in einer kalten Umgebung10. Arthrobacter sp. PAMC26654 nutzte den Polysaccharid- oder Kohlenhydratabbau als Energiequelle, um sich an kalte Umgebungen anzupassen und dort zu überleben, insbesondere CAZymes, die bei niedrigen Temperaturen aktiv sind27. Genomanalysen haben genomische Informationen und evolutionäre Erkenntnisse über verschiedene Stämme und Arten aus kalten Umgebungen enthüllt. Im Vergleich zu Eukaryoten sind die Eigenschaften des Glykogenstoffwechsels bei Prokaryoten jedoch noch nicht gut untersucht, und der Stoffwechsel von Niedertemperatur-Mikroorganismen ist nicht gut verstanden28. Die Analyse des vollständigen W-6-Genoms legte nahe, dass der Glykogen- und Trehalose-Metabolismus mit CAZymes-Genen assoziiert ist. Die CAZyme könnten eine wichtige Bedeutung bei der Anpassung an niedrige Temperaturen haben, insbesondere für Gene im Zusammenhang mit dem Glykogen- und Trehalose-Metabolismus9,10,23,24.

Wir haben die Stoffwechselwege des Glykogenstoffwechsels und des Trehalosestoffwechsels in 14 Pseudomonas-Stämmen analysiert. Basierend auf der Zusammensetzung von GH, GT und anderen Hauptenzymen in 14 ausgewählten Genomen wurden Ähnlichkeiten verschiedener Umgebungen analysiert. Die enthaltenen Gene von W-6 unterschieden sich von denen anderer Pseudomonas-Stämme (GlgP, GlgC, TreA und TreR). Im Vergleich zu den anderen 14 Stämmen kam es nur bei W-6 vor. Daher hatte W-6 leicht andere Wege zur Energiegewinnung oder zum Abbau von Polysacchariden als andere Pseudomonas-Arten. (Tabelle S6). Unter den Genen, die mit dem Glykogenstoffwechsel und dem Trehalosestoffwechsel zusammenhängen, fehlten in allen 14 Stämmen die Gene glgC, otsA, otsB und treT. Daher sind die meisten Pseudomonas spp. OtsA/B fehlte, wohingegen TreS und TreY/Z29 kodiert wurden. Unter diesen 14 Genomen gab es teilweise Genüberlappungen zwischen W-6 und den anderen 13 Stämmen, wie GlgX, GlgA, GlgB, OtsA, TreS, TreZ, TreY, TreP und SugB, aber es gab auch Unterschiede. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Glykogen- und Trehalose-Stoffwechselwege in W-6 anders als in den 13 Stämmen existieren könnten. Dies könnte einer der Schlüsselfaktoren für die Anpassung von W-6 an eine Umgebung mit niedrigen Temperaturen sein.

Die Beziehung zwischen den Stoffwechselwegen von Glykogen und Trehalose in Bakterien ist in Abb. 6 dargestellt. Es gibt drei Hauptwege des Glykogenstoffwechsels. Der häufigste Glykogenstoffwechselweg in Bakterien umfasst das glgC-Gen10, während das galU-Gen bei Pilzen im Allgemeinen häufiger vorkommt11. Die Stoffwechselwege von Trehalose sind bei Bakterien gut bekannt, beispielsweise eine Abwehrstrategie, die die Akkumulation von Trehalose beinhaltet. Trehalose und Glykogen wurden in Propionibacterium freudenreichii unter kalten Bedingungen stark angereichert30. OtsBA, TreYZ und TreS existierten in Arthrobacter sp. PAMC2556429, Bacillus sp. TK29, P. freudenreichii30 und Mycobacterium sp.31, aber OtsA/B fehlt in den meisten Pseudomonas spp.29. Bei einigen Bakterien wurden fünf Trehalose-Stoffwechselwege beschrieben14, beispielsweise TPS/TPP, TreY-TreZ, TreP, TreS und TreT, die das Überleben in kalten Umgebungen erleichtern. Trehalose war für die Lebensfähigkeit von E. coli bei niedrigen Temperaturen unerlässlich32. Basierend auf der CAZy-Genannotation enthielt P. sivasensis W-6 die meisten Gene, die an diesen beiden Stoffwechselwegen beteiligt sind, mit Ausnahme der Gene glgC, otsA, otsB und treT. Das Gen glgC kodiert für ein Schlüsselenzym im Glykogen-Stoffwechselweg, sodass der Glykogen-Stoffwechselweg häufig bei Bakterien mit glgC beteiligt ist, in W-6 jedoch nicht vorhanden ist. Die galU-Gene sind im Allgemeinen am Glykogenstoffwechsel in Pilzen beteiligt, die galU-Gene sind jedoch im W-6-Genom vorhanden, was darauf schließen lässt, dass sich der Glykogenstoffwechsel in W-6 von denen in allgemeinen Bakterien unterscheiden kann. Es gab vier Hauptwege des Trehalose-Stoffwechsels in S. acidocaldarius, darunter TPS/TPP, TreY-TreZ, TreH und TreT.33 W-6 enthielt jedoch keine otsA-, otsB- und treT-Gene, sodass in W-6 drei Trehalose-Stoffwechselwege an den TreY-TreZ-, TreS- und TreP-Wegen beteiligt waren. Dies könnte ein einzigartiges Merkmal von W-6 bei der Anpassung an Umgebungen mit niedrigen Temperaturen sein. Derzeit ist die Rolle von Trehalose und Glykogen bei Pseudomonas spp. nur unzureichend verstanden.

Glykogen- und Trehalose-Stoffwechselweg in W-6. Das graue Kästchen stellt die Gene dar, die mit dem Glykogenstoffwechsel in Zusammenhang stehen, und das orangefarbene Kästchen stellt die mit dem Trehalosestoffwechsel verbundenen Gene dar. Die violette Linie repräsentiert den Glykogen-Stoffwechselweg und die rote Linie den Trehalose-Stoffwechselweg.

Somit waren die Stoffwechselwege von Glucose, Trehalose und Maltose miteinander verbunden. Es bietet ein Verständnis der Überlebensanpassung in der kalten Umgebung durch eine vergleichende Analyse des Glykogenstoffwechsels und des Trehalosewegs verschiedener Pseudomonas spp.

Die Membranflüssigkeit durch Veränderung des ungesättigten Fettsäureprofils ist eine universelle Strategie zur Anpassung an eine kalte Umgebung34. Acht Gene (bdcA, bacC, fadB, fadJ, tesA, tesB, fabC und fabG) wurden als an der Synthese ungesättigter Fettsäuren beteiligt identifiziert, und diese Gene waren höchstwahrscheinlich wichtig für die Aufrechterhaltung der Membranflüssigkeit von W-6 bei Kälte Stress. Glutathion hält die Redoxhomöostase der Zellen aufrecht und schützt die Membranlipide vor oxidativem Stress, der durch Kältestress verursacht wird35. Es wurden Glutathion-Synthase (GshB, W-6-4258), zwei Schlüsselgene, die für Glutathion-Peroxidase (Gpx2, W-6-2237) kodieren, und Glutathion-Reduktase (Gor, W-6-1098), die am Glutathion-Zyklus beteiligt sind, identifiziert im W-6-Genom, was darauf hinweist, dass Glutathion die psychrotolerante Wirkung des Stammes W-6 fördern kann. Das Kälteschockprotein (CSP) CspA, Glutathionperoxidase und Superoxiddismutase wurden in W-6 und Pseudomonas sp. gefunden. HS636. Die Kälteadaptationsmechanismen von Pseudomonas sp. HS6 wird auf die Verwendung von CSP und Aminosäuren zurückgeführt36. Typische CSPs spielten auch in P. fluorescens PF0837 und KUIN-138. Polyhydroxyalkanoat (PHA), das am Kohlenhydratstoffwechsel beteiligt ist, war ein wichtiger Faktor beim Wachstum von Pseudomonas sp. 14-3 Belastung bei niedrigen Temperaturen39. Durch eine vergleichende Analyse der Stoffwechselwege verschiedener Pseudomonas-Arten haben wir mehr über Kälteanpassungsstrategien erfahren.

Zweikomponenten-Regulationssysteme sind für das Überleben von Bakterien in kalten Umgebungen verantwortlich40. Ein Zweikomponenten-Regulationssystem besteht aus einer Sensorkinase und einem Reaktionsregulator. Im W-6-Genom wurden 199 Paare von Sensorkinasen und Reaktionsregulatoren gefunden, die möglicherweise als multifunktionaler Sensor fungieren und zahlreiche auf Kälte reagierende Gene sowie Reaktionen auf osmotischen, Salz- und oxidativen Stress steuern41.

Das sfsA (W-6-4762) war das kälteinduzierte regulatorische Gen im Stamm W-6, das zum DNA-bindenden Transkriptionsregulator gehörte und den Zuckerkatabolismus regulierte. Die Produktion von RNA-Helikasen (deaD, hrpB, hrpA, pcrA, rapA, rhlE, rhlB, dbpA, uvrD und ywqA) könnte auch durch niedrige Temperaturen induziert werden und dann die Bildung strukturierter Nukleinsäuren verhindern.

Die Antisense-Transkription kann unter Kältestress zu einer Ungenauigkeit der RNA-Sekundärstruktur, einer geringen Effizienz, einer langsamen Geschwindigkeit und einer falschen Wiedergabetreue der Transkription und Translation führen41. In Bakterien ist nusG ein Co-Faktor des Rho-Transkriptionsterminators und könnte die genomweite Antisense-Transkriptionskombination mit Histon-ähnlichem Nukleoidstrukturierungsprotein (H-NS) und Rho-abhängigen Transkriptionsterminatoren verringern42. Daher kann die Expression von nusA/nusB/nusG (W-6-4739, W-6-4562 bzw. W-64489) W-6 dabei helfen, die Antisense-Transkription zum Überleben in einer kalten Umgebung zum Stillstand zu bringen.

Das rpsU-Gen (W-6-4435) im W-6-Genom, das für das Protein der ribosomalen 30S-Untereinheit kodiert, könnte eine wichtige Rolle bei der Kälteanpassung spielen. Wie bei Synechocystis berichtet werden kann, wurde das rpsU-Gen unter Kältestress um das Zehnfache induziert43. Der Ribosomen-Chaperon-Triggerfaktor (Tig, W-6-0528) in W-6 kann bei der frühen Faltung helfen und Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen verhindern. Das SmpB-Protein (W-6-4717) in W-6 wird benötigt, um Ribosomen zu retten, die aufgrund fehlerhafter Nachrichten blockiert sind43.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Analyse des W-6-Genoms darauf hindeutet, dass das kälteadaptierte Bakterium W-6 Glykogen- und Trehalose-Stoffwechselwege aufweist, die mit CAZyme-Genen assoziiert sind, und dass diese als Energiequellen für die Anpassung und das Überleben in kalten Umgebungen genutzt werden. Die Stoffwechselwege von Glucose, Trehalose und Maltose waren miteinander verbunden. Es vermittelt ein Verständnis der Überlebensanpassung in einer kalten Umgebung von W-6. Anpassungen des W-6-Stamms an niedrige Temperaturen wurden auch durch die Membranfluidität durch Änderung des ungesättigten Fettsäureprofils, der Zweikomponenten-Regulationssysteme, der Antisense-Transkription, der Rolle der rpsU-Gene im Translationsprozess usw. ermöglicht.

Um die Kälteanpassungsmechanismen von Bakterien in Plateau-Feuchtgebieten aufzuklären, wurden einige kälteadaptierte Bakterien gewonnen. P. sivasensis W-6 wurde am 23. Mai 2019 aus einer Wasserprobe isoliert, die im Feuchtgebiet des Napahai-Plateaus (27° 53′ 36′′ N 99° 38′ 24′′ E) in der Provinz Yunnan, China, entnommen wurde. Der Stamm W -6 wurde bei verschiedenen Temperaturen bei 4 °C, 10 °C, 15 °C, 20 °C, 25 °C, 30 °C und 37 °C auf sterilen LB-Festmedien inkubiert. Der bakterielle Universalprimersatz 27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG, 1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT wurde für die 16S-rRNA-Amplifikation und molekulare Identifizierung verwendet44. Die amplifizierten Fragmente wurden einer DNA-Sequenzierung und Verwendung von BLASTn zur Bestimmung der Bakterienart unterzogen. Die PCR-Amplifikationsbedingungen mit 30 Amplifikationszyklen waren wie folgt: 95 °C für 4 Minuten, 95 °C für 40 Sekunden, 50 °C für 45 Sekunden und 72 °C für 90 Sekunden. Zur genomischen DNA-Isolierung wurde der Stamm P. sivasensis W-6 in einem sterilen LB-Flüssigmedium bei 15 °C und 150 U/min kultiviert. Hochwertige genomische DNA des W-6 wurde mit dem Biospin-Bakterien-Genom-DNA-Extraktionskit extrahiert und durch Gelelektrophorese auf 0,7 % Agarose verifiziert. Der W-6-Stamm wurde beim China General Microbiological Culture Collection Center mit der Nummer CGMCC 1.62087 hinterlegt.

Die Genomsequenzierungsbibliotheken wurden vorbereitet und dann auf PacBio RSII sequenziert. Das Protokoll zur Bibliotheksvorbereitung sah wie folgt aus: Die extrahierte DNA-Probe wurde segmentiert, gefolgt von der Reparatur von DNA-Schäden und der Endreparatur. Als nächstes wurde der Spleiß verbunden, gefolgt von einem Exo III- und Exo IV-Verdau, und dann wurde die DNA weiter gereinigt, um die kürzeren Bibliotheks- und Adapterdimere zu entfernen. Gleichzeitig ist es zur Verbesserung der Sequenzierungsqualität erforderlich, eine Blue Pippin (BP)-Fragmentselektion in der Bibliothek durchzuführen, um kurze Fragmentbibliotheksmoleküle zu entfernen. FastQC45 führt Qualitätskontrollen und Filterbedingungen durch, um Lesevorgänge mit einer Länge von weniger als 100 und Lesevorgängen mit einem durchschnittlichen Qualitätswert von weniger als 0,80 zu entfernen. Die qualitätsgefilterten Lesevorgänge (Q ≥ 100) wurden mit der HGAP46-Software basierend auf PacBio-Daten zusammengestellt und durch Überlappung gespleißt und zusammengestellt. Beim Scaffolding wurden die Alignments zwischen Contigs und Reads genutzt, um die relative Ausrichtung und Reihenfolge der Contigs zu bestimmen, was letztlich zu längeren Scaffolds führte und die weitere Analyse und Interpretation genomischer Daten erleichterte44. Die ORFs wurden mit der Glimmer47-Software vorhergesagt und mithilfe von BLAST mit NCBI Nr. und Pfam48 (https://pfam.xfam.org) als Referenzdatenbanken identifiziert. Die funktionelle Genannotation wurde von den Datenbanken NCBI nr, Swiss-Prot49, COG50 und KEGG51 durchgeführt. Die tRNA und rRNA wurden mit tRNA scan-SE 1.2152 bzw. RNAmmer53 vorhergesagt. Geclusterte, regelmäßig beabstandete kurze palindromische Wiederholungen (CRISPRs)/Cas-Gene wurden mit dem CRISPR/Cas-Finder-Online-Tool (http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/) identifiziert. Transposon PSI (http://transposonpsi.sourceforge.net/) wurde verwendet, um transponierbare Faktoren vorherzusagen. Der Prophage wurde mit Prophage Hunter (https://pro-hunter.genomics.cn/) vorhergesagt. CAZymes wurde mit dem automatisierten Annotations-Webserver für kohlenhydrataktive Enzyme-dbCAN-Metaserver (http://bcb.unl. edu/dbCAN2/blast.php) annotiert. Die Virulenzgene wurden mithilfe der Virulence Factor of Bacterial Pathogen-Datenbank (VFDB) und des Virulence Finder v2.0 (http://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/) vorhergesagt. Das Muster der Antibiotikaresistenz wurde mit der Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) untersucht. Laut der Antibiotic Resistance Genes Database (ARDB) (ardbAnno1.0)54 haben wir RGI verwendet, um Geninformationen im Zusammenhang mit Antibiotikaresistenzen zu erforschen. Die Genomsequenz wurde in der GenBank hinterlegt.

Die gesamte Genomsequenz des W-6-Stammes wurde in der NCBI GenBank unter der Zugangsnummer CP058533.1 hinterlegt. CheckM18 wurde verwendet, um die Qualität und Vollständigkeit des W-6 zu bewerten. ANI- und dDDH-Werte wurden mit fastANI55 und GGDC (https://ggdc.dsmz.de/faq.php) berechnet. Die Genomphylogenie von P. sivasensis W-6 wurde mit der MEGA X56-Software für die phylogenetische Baumkonstruktion mit der Maximum-Likelihood-Methode analysiert. Für die vergleichende Genomanalyse wurden die Sequenzen des phylogenetisch nächsten Stammtyps mit dem verfügbaren Genom von P. sivasensis W-6 und gut charakterisierten Genomen von P. sivasensis ausgewählt (Tabelle S1), die aus der NCBI-Datenbank abgerufen wurden. Die vergleichenden Genommerkmale mit P. sivasensis W-6 sind in Tabelle S2 aufgeführt. Für die Genomanalyse und -visualisierung wurde die Software Mauvey57 verwendet.

Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten Datensätze sind in der NCBI GenBank-Datenbank verfügbar, [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP058533].

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Fakultät für Biowissenschaften und Technologie, Universität für Wissenschaft und Technologie Kunming, Kunming, China

Lingling Xiong, Yanmei Li, Hang Yu und Yunlin Wei

Medizinische Fakultät, Universität für Wissenschaft und Technologie Kunming, Kunming, China

Haiyan Li & Xiuling Ji

Yunnan International Joint Laboratory of Research and Development of Crop Safety Production on Heavy Metal Pollution Areas, Kunming, China

Haiyan Li & Xiuling Ji

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Korrespondenz mit Haiyan Li oder Xiuling Ji.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Xiong, L., Li, Y., Yu, H. et al. Gesamtgenomanalyse und Kälteanpassungsstrategien von Pseudomonas sivasensis W-6, isoliert aus dem Feuchtgebiet des Napahai-Plateaus. Sci Rep 13, 14190 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41323-x

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Eingegangen: 02. Januar 2023

Angenommen: 24. August 2023

Veröffentlicht: 30. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41323-x

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